16S-rRNA-Sequenzierung: Prinzip, Ablauf und Grenzen erklärt
Was ist 16S-rRNA-Sequenzierung?
Die 16S-rRNA-Sequenzierung ist eine molekularbiologische Methode zur Untersuchung von Bakterien und Archaeen in einer Probe. Dafür wird meist nicht die RNA, sondern die DNA des 16S-rRNA-Gens analysiert. Weil dieses Gen bei vielen Bakterien vorkommt und zugleich variable Abschnitte besitzt, kann die Methode die Zusammensetzung einer mikrobiellen Gemeinschaft erfassen – zum Beispiel in einer Stuhlprobe. Sie zeigt vor allem, welche Mikroorganismen nachweisbar sind und in welchem relativen Anteil sie vorkommen. Sie belegt jedoch nicht automatisch, welche Funktionen diese Mikroorganismen tatsächlich ausüben.
Das Prinzip der 16S-rRNA-Sequenzierung
Das 16S-rRNA-Gen ist ungefähr 1.500 Basenpaare lang und codiert einen Bestandteil des bakteriellen beziehungsweise archaeellen Ribosoms. Es enthält konservierte Regionen, die bei vielen Zielorganismen ähnlich sind, sowie variable Regionen. An die konservierten Bereiche können Primer binden, während die Unterschiede in den variablen Abschnitten als genetische Vergleichsmerkmale dienen.
In der Praxis werden entweder einzelne variable Bereiche, etwa V3–V4, oder das nahezu vollständige Gen untersucht. Die erhaltenen Sequenzen werden mit kuratierten Referenzdatenbanken verglichen. Je nach Datenqualität, Datenbank und biologischer Ähnlichkeit ist eine Einordnung auf Ebene der Familie, Gattung oder manchmal Art möglich. Eine sichere Bestimmung bis zur Art oder zum Stamm ist nicht in jeder Probe und nicht für jedes Bakterium möglich.
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Wie funktioniert die 16S-rRNA-Sequenzierung?
1. Probengewinnung und Stabilisierung
Bei der Analyse des Darmmikrobioms wird häufig eine Stuhlprobe untersucht. Entscheidend sind eine möglichst standardisierte Entnahme, eine geeignete Lagerung und der zeitnahe Transport oder ein Stabilisierungspuffer. Diese Schritte sollen verhindern, dass sich die DNA-Qualität oder die Zusammensetzung der Probe durch Lagerungsbedingungen unnötig verändert.
2. DNA-Extraktion
Aus der Probe wird die gesamte enthaltene DNA isoliert. Dazu gehören die DNA von Bakterien und Archaeen, aber auch DNA anderer Organismen. Verfahren wie mechanisches Aufbrechen mit kleinen Partikeln, das sogenannte Bead-Beating, können helfen, auch widerstandsfähige Zellwände aufzuschließen. Extraktionsmethode, Probenbeschaffenheit und Kontrollen beeinflussen die Qualität des Ergebnisses.
3. PCR-Amplifikation
Mit einer Polymerase-Kettenreaktion, kurz PCR, werden die ausgewählten Abschnitte des 16S-rRNA-Gens vervielfältigt. Die Primer binden an konservierte Bereiche und rahmen die dazwischenliegenden variablen Regionen ein. Bei einer Full-Length-Analyse wird möglichst das gesamte Gen mit einer Länge von etwa 1.500 Basenpaaren amplifiziert.
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Die Wahl der Primer ist wichtig: Nicht jeder Primer erfasst alle Bakterien gleich gut. Dadurch kann ein sogenannter Primer-Bias entstehen, bei dem manche Gruppen in den Daten über- oder unterrepräsentiert erscheinen.
4. Vorbereitung der Sequenzierbibliothek
Die vervielfältigten DNA-Fragmente, auch Amplikons genannt, werden für die jeweilige Sequenzierplattform vorbereitet. Dabei können Adapter und individuelle Barcodes angebracht werden. So lassen sich mehrere Proben in einem Lauf untersuchen und anschließend bioinformatisch wieder einzelnen Proben zuordnen.
5. Sequenzierung
Eine Sequenzierplattform liest die Reihenfolge der Basen in den DNA-Fragmenten aus. Für Full-Length-16S-rRNA-Sequenzierung werden häufig Long-Read-Verfahren eingesetzt, beispielsweise PacBio-SMRT oder Oxford Nanopore. Auch andere Plattformen können für kürzere 16S-Abschnitte verwendet werden. Die technische Genauigkeit, die Leselänge und die Qualitätssicherung unterscheiden sich je nach Verfahren.
6. Qualitätskontrolle und bioinformatische Verarbeitung
Die Rohdaten werden zunächst auf Qualität geprüft. Schlechte oder zu kurze Sequenzen können entfernt werden. Außerdem werden mögliche Kontaminationen und chimäre Sequenzen berücksichtigt. Die Daten können anschließend zu Amplikon-Sequenzvarianten, kurz ASVs, verarbeitet oder in operationale taxonomische Einheiten, kurz OTUs, gruppiert werden. ASVs unterscheiden sich dabei in der Regel feiner als klassische OTU-Cluster.
7. Taxonomische Zuordnung
Die bereinigten Sequenzen werden mit Referenzdatenbanken wie SILVA oder GTDB verglichen. Das Ergebnis ist eine taxonomische Einordnung auf unterschiedlichen Ebenen. Die Aussagekraft hängt unter anderem von der Sequenzlänge, der Qualität der Referenzdatenbank und davon ab, wie ähnlich sich nahe verwandte Organismen sind.
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Die Ergebnisse werden häufig als relative Häufigkeiten dargestellt. Zusätzlich können Forschende die Alpha-Diversität, also die Vielfalt innerhalb einer Probe, und die Beta-Diversität, also Unterschiede zwischen Proben, untersuchen. Solche Auswertungen können wissenschaftliche Zusammenhänge aufzeigen. Aus einem einzelnen Profil lässt sich jedoch nicht direkt ableiten, ob eine Person gesund oder krank ist oder welche Maßnahme individuell geeignet wäre.
Full-Length-16S-Sequenzierung und V3–V4 im Vergleich
Bei der klassischen 16S-Analyse werden oft nur bestimmte Genabschnitte sequenziert, zum Beispiel V3–V4. Die Full-Length-16S-Sequenzierung erfasst dagegen möglichst das gesamte 16S-rRNA-Gen. Dadurch steht mehr Vergleichsinformation zur Verfügung, was die taxonomische Zuordnung in manchen Fällen verbessern kann.
- Mehr Sequenzinformation: Mehrere variable Regionen können bei der Unterscheidung nah verwandter Bakterien hilfreich sein.
- Möglicherweise höhere taxonomische Auflösung: Eine Einordnung bis zur Art kann wahrscheinlicher werden, ist aber nicht garantiert.
- Andere technische Anforderungen: Längere Amplikons stellen höhere Anforderungen an PCR, Sequenzierung und Qualitätskontrolle.
- Primer-Bias bleibt möglich: Die vollständige Genlänge beseitigt Verzerrungen durch die Primerwahl nicht automatisch.
Welche Variante sinnvoll ist, hängt von der Forschungsfrage, der Probe, der verfügbaren Technik und der Qualität der Referenzdatenbank ab.
Unterschied zwischen 16S- und 18S-rRNA-Sequenzierung
Die beiden Methoden untersuchen unterschiedliche Organismengruppen:
- 16S-rRNA-Sequenzierung: vor allem Bakterien und Archaeen.
- 18S-rRNA-Sequenzierung: Eukaryoten, darunter Pilze, Hefen und bestimmte Einzeller.
Wer die Pilzgemeinschaft im Darm, das sogenannte Mykobiom, untersuchen möchte, benötigt daher in der Regel einen passenden eukaryotischen Marker wie 18S. Die 16S-Methode erfasst diese Organismen nicht vollständig. Je nach Fragestellung können verschiedene Markeranalysen kombiniert werden.
16S-rRNA-Sequenzierung und RNA-Sequenzierung: Was ist der Unterschied?
Die Begriffe werden manchmal verwechselt. Bei der 16S-rRNA-Gensequenzierung wird überwiegend die DNA eines Markergens untersucht. Die Methode dient vor allem der taxonomischen Profilierung von Bakterien und Archaeen.
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Eine RNA-Sequenzierung, häufig RNA-Seq genannt, untersucht dagegen ein breiteres Spektrum der transkribierten RNA. Sie kann Hinweise darauf liefern, welche Gene in einer Probe abgelesen werden. Damit sind potenziell funktionelle Einblicke möglich, die Methode ist jedoch komplexer und beantwortet eine andere wissenschaftliche Frage. Auch RNA-Seq liefert nicht automatisch eine individuelle Diagnose.
Welche Vorteile hat die Methode für die Darmmikrobiom-Analyse?
- Sie kann viele Bakteriengruppen in einer gemischten Probe parallel erfassen.
- Sie ist für vergleichende Untersuchungen zwischen Proben und Gruppen geeignet.
- Die 16S-Sequenz ist ein etablierter Marker in der mikrobiologischen Forschung.
- Full-Length-Daten können bei bestimmten Organismen eine genauere taxonomische Einordnung ermöglichen.
- Die Methode kann mit anderen Verfahren wie 18S-rRNA-Sequenzierung oder Shotgun-Metagenomik kombiniert werden.
Grenzen und wichtige Qualitätsfaktoren
Eine 16S-rRNA-Sequenzierung beschreibt in erster Linie die Zusammensetzung der nachgewiesenen Bakteriengemeinschaft. Sie misst nicht direkt Stoffwechselprodukte, Genaktivität oder die tatsächliche Funktion eines Organismus. Außerdem werden Ergebnisse häufig als relative Häufigkeiten angegeben. Ein höherer relativer Anteil einer Gruppe bedeutet daher nicht automatisch, dass ihre absolute Zahl gestiegen ist.
Weitere mögliche Einflussfaktoren sind die Entnahme und Lagerung der Probe, die DNA-Extraktion, die Primer, die Sequenzierplattform, die bioinformatische Pipeline und die verwendete Referenzdatenbank. Kontaminationen oder unvollständige Referenzdatenbanken können die Zuordnung erschweren.
Zu einer sorgfältigen Laborpraxis gehören geeignete positive und negative Kontrollen, dokumentierte Abläufe, validierte Primer, transparente Qualitätskriterien und eine möglichst aktuelle Referenzdatenbank. Ergebnisse sollten außerdem immer im Kontext der konkreten Fragestellung und der Messmethode betrachtet werden.
Wie sollte man ein 16S-Ergebnis einordnen?
Ein Mikrobiomprofil ist eine Momentaufnahme unter den jeweiligen Proben- und Laborbedingungen. Unterschiede zwischen Personen können durch Ernährung, Medikamente, Alltag, Alter, Probenzeitpunkt und viele weitere Faktoren beeinflusst werden. Einzelne Bakteriennamen oder ein Diversitätswert erlauben daher keine verlässliche Aussage über den individuellen Gesundheitszustand.
2-Minuten-Selbstcheck Ist ein Darmmikrobiom-Test sinnvoll für dich? Beantworte ein paar kurze Fragen und finde heraus, ob ein Mikrobiom-Test für dich wirklich sinnvoll ist. ✔ Dauert nur 2 Minuten ✔ Basierend auf deinen Symptomen & deinem Lebensstil ✔ Klare Ja/Nein-Empfehlung Prüfen, ob ein Test für mich sinnvoll ist →Die 16S-rRNA-Sequenzierung ist vor allem ein Forschungs- und Analysetool. Bei anhaltenden, starken oder sich verschlimmernden Beschwerden sollte die medizinische Abklärung durch eine qualifizierte Fachperson erfolgen. Ein Mikrobiombericht sollte nicht als Ersatz für eine ärztliche Diagnose oder Behandlung verwendet werden.
Häufige Fragen
Wie sequenziert man 16S-rRNA?
Zunächst wird DNA aus einer geeigneten Probe extrahiert. Danach werden ausgewählte Abschnitte des 16S-rRNA-Gens per PCR vervielfältigt, für die Sequenzierung vorbereitet und auf einer passenden Plattform gelesen. Anschließend werden die Rohdaten qualitätsgeprüft, verarbeitet und mit Referenzdatenbanken verglichen.
Was ist das Grundprinzip der 16S-Sequenzierung?
Das Grundprinzip besteht darin, ein bei Bakterien und Archaeen verbreitetes Gen mit konservierten und variablen Bereichen zu untersuchen. Die variablen Sequenzabschnitte dienen als Vergleichsmerkmale, um die in einer Probe vorhandenen Mikroorganismen taxonomisch einzuordnen.
Kann die 16S-rRNA-Sequenzierung eine Krankheit diagnostizieren?
Nein. Die Methode kann ein mikrobielles Profil liefern, ist aber für sich genommen keine individuelle Diagnose. Die Bedeutung eines Ergebnisses hängt von der Fragestellung, der Qualität der Analyse und dem medizinischen Kontext ab. Bei Beschwerden ist eine Beratung durch eine qualifizierte medizinische Fachperson sinnvoll.
Fazit
Die 16S-rRNA-Sequenzierung ist eine etablierte Methode, um Bakterien und Archaeen in komplexen Proben wie Stuhl zu untersuchen. Ihr Ablauf reicht von Probenentnahme und DNA-Extraktion über PCR und Sequenzierung bis zur bioinformatischen Klassifizierung. Full-Length-Analysen können zusätzliche taxonomische Informationen liefern, ersetzen aber keine Funktionsanalyse oder medizinische Beurteilung. Für ein umfassenderes Bild kommen je nach Fragestellung ergänzende Verfahren wie 18S-rRNA-Sequenzierung oder Shotgun-Metagenomik infrage.