Shotgun-Metagenomik verständlich erklärt: Ablauf und Nutzen
Was ist Shotgun-Metagenomik?
Shotgun-Metagenomik ist eine Methode, mit der die gesamte DNA einer mikrobiellen Probe untersucht wird. Anders als bei einer gezielten Amplifikation wird nicht nur ein bestimmter Markerbereich vervielfältigt. Stattdessen wird die vorhandene DNA in viele Fragmente geteilt und anschließend parallel sequenziert. So können Forschende Hinweise auf verschiedene Mikroorganismen und auf Gene mit potenziellen Funktionen gewinnen.
Bei einer Stuhlprobe kann die Methode beispielsweise Informationen über das Darmmikrobiom liefern. Das Ergebnis beschreibt jedoch vor allem, welche DNA in der Probe gefunden wurde und welches funktionelle Potenzial daraus abgeleitet werden kann. Es zeigt nicht automatisch, welche Gene gerade aktiv sind oder welche Ursache hinter einem Symptom steht.
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Was bedeutet „Genom“ in der Biologie?
Ein Genom ist die Gesamtheit der genetischen Information eines Organismus. Diese Information liegt meist in Form von DNA vor und enthält unter anderem Gene, die Anweisungen für biologische Prozesse tragen. Ein menschliches Genom gehört zu einem Menschen; ein bakterielles Genom gehört zu einem Bakterium. In einer metagenomischen Probe liegen DNA-Abschnitte vieler Organismen gemeinsam vor. Die Shotgun-Metagenomik versucht, diese gemischten Signale zuzuordnen und auszuwerten.
Shotgun-Metagenomik und 16S-rRNA-Sequenzierung im Vergleich
Die 16S-rRNA-Sequenzierung untersucht einen ausgewählten Genabschnitt, der vor allem zur Einordnung von Bakterien und Archaeen dient. Sie ist häufig kostengünstiger, liefert aber weniger Informationen über Pilze, Viren und funktionelle Gene. Shotgun-Metagenomik erfasst viele DNA-Fragmente aus der gesamten Probe und kann dadurch je nach Probenqualität und Referenzdatenbank eine feinere taxonomische Auflösung ermöglichen.
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| Merkmal | 16S-rRNA-Sequenzierung | Shotgun-Metagenomik |
|---|---|---|
| Untersuchte DNA | Ausgewählter Markerbereich | Viele DNA-Fragmente aus der gesamten Probe |
| Typische Organismen | Vor allem Bakterien und Archaeen | Bakterien, Archaeen, Pilze, Viren und Phagen, sofern erfasst |
| Funktionelle Informationen | Nur eingeschränkt ableitbar | Potenzielle Gene und Stoffwechselwege können analysiert werden |
| Aufwand und Kosten | Meist niedriger | Meist höher durch Sequenzierung und Datenanalyse |
Keine der beiden Methoden ist für jede Fragestellung automatisch die beste Wahl. Entscheidend sind unter anderem Probenart, Ziel, gewünschte Auflösung, Budget und verfügbare Datenbanken.
Wie funktioniert die Shotgun-Metagenom-Sequenzierung?
1. Probenentnahme und Konservierung
Mögliche Proben stammen aus dem Darm, dem Mund, von der Haut, aus Erde, Wasser oder Biofilmen. Die Entnahme sollte standardisiert und mit geeigneten, möglichst DNA-freien Materialien erfolgen. Lagerung und Transport können die Qualität der DNA und damit die Ergebnisse beeinflussen.
2. DNA-Extraktion
Im Labor wird die DNA aus der Probe isoliert. Die Methode sollte unterschiedliche Zelltypen möglichst gleichmäßig aufschließen. Bei Stuhl- oder Umweltproben können hemmende Stoffe die Analyse beeinträchtigen. Deshalb werden häufig mechanische Verfahren wie Bead-Beating mit enzymatischen oder chemischen Schritten kombiniert.
3. Bibliotheksvorbereitung
Die DNA wird je nach Verfahren fragmentiert, an den Enden vorbereitet und mit Sequenzierungsadaptern versehen. Barcodes ermöglichen es, mehrere Proben in einem Lauf zu bearbeiten und später wieder zu trennen. Für geringe DNA-Mengen gibt es spezielle Protokolle, die jedoch zusätzliche Verzerrungen verursachen können.
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Hochdurchsatzplattformen lesen die DNA-Fragmente aus. Illumina liefert typischerweise kurze und sehr genaue Reads. PacBio HiFi kann lange, konsensgenaue Reads erzeugen. Oxford Nanopore ermöglicht lange Reads und eine Analyse in Echtzeit, wobei Genauigkeit und Auswertung vom jeweiligen Protokoll abhängen. Die erforderliche Sequenzierungstiefe richtet sich nach der Komplexität der Probe und dem Ziel der Untersuchung.
5. Bioinformatik-Pipeline
- Qualitätskontrolle: Adapter und Abschnitte niedriger Qualität werden entfernt.
- Entfernung von Wirts-DNA: Bei menschlichen oder pflanzlichen Proben kann DNA des Wirts einen großen Anteil ausmachen und wird, sofern erforderlich, aus der Analyse ausgeschlossen.
- Taxonomisches Profiling: Sequenzen werden mit Referenzdatenbanken verglichen, um mögliche Organismen zuzuordnen. Beispiele für Werkzeuge sind Kraken2, MetaPhlAn und Centrifuge.
- Funktionelle Annotation: Gene und potenzielle Stoffwechselwege werden beispielsweise mithilfe von KEGG, EggNOG, COG oder Pfam eingeordnet.
- Assemblierung und Binning: Überlappende Reads können zu längeren Contigs zusammengesetzt werden. Daraus lassen sich unter bestimmten Bedingungen metagenomisch assemblierte Genome, kurz MAGs, rekonstruieren.
- Visualisierung: Heatmaps, Krona-Darstellungen sowie PCA- oder NMDS-Diagramme helfen, komplexe Ergebnisse übersichtlich zu vergleichen.
Welche Informationen kann die Methode liefern?
- Zusammensetzung einer mikrobiellen Gemeinschaft
- Hinweise auf Unterschiede zwischen Proben oder Zeitpunkten
- Potenzielle Gene für Stoffwechselprozesse
- Informationen zum Resistom, also zu möglichen Antibiotikaresistenzgenen
- Hinweise auf Viren, Phagen und Pilze, wenn diese ausreichend erfasst und in Referenzdatenbanken vertreten sind
- Mögliche Rekonstruktion einzelner mikrobieller Genome
Die funktionelle Annotation beschreibt ein genetisches Potenzial. Sie beweist nicht, dass ein Gen aktiv ist oder dass ein bestimmter Stoff tatsächlich gebildet wird. Für Aktivität und biologische Wirkung können ergänzende Untersuchungen wie Metatranskriptomik, Metaproteomik oder Metabolomik erforderlich sein.
Anwendungen in Forschung und Praxis
Darmmikrobiom und Mikrobiomforschung
Shotgun-Metagenomik kann genutzt werden, um die Vielfalt und das funktionelle Potenzial des Darmmikrobioms zu untersuchen. Forschungsarbeiten vergleichen beispielsweise mikrobielle Gemeinschaften unter verschiedenen Bedingungen. Solche Zusammenhänge sind interessant, erlauben bei Einzelpersonen aber normalerweise keine sichere Aussage über die Ursache von Beschwerden oder über eine konkrete Behandlung.
Klinische und öffentliche Gesundheitsforschung
In geeigneten Forschungs- und Laborumgebungen kann die Methode bei der Suche nach bekannten oder unerwarteten Mikroorganismen, bei der Untersuchung von Resistenzgenen und bei der Überwachung von Krankheitserregern helfen. Die klinische Bedeutung hängt von Probenqualität, Validierung, Kontrollen und der ärztlichen Einordnung ab. Ein Forschungsergebnis ist nicht automatisch ein zugelassener diagnostischer Befund.
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Landwirtschaft und Umwelt
Weitere Einsatzgebiete sind Pflanzen- und Bodenmikrobiome, Gewässer, Abwasser, Biofilme sowie die Untersuchung mikrobieller Prozesse im Kohlenstoffkreislauf. In der Biotechnologie können metagenomische Daten außerdem Hinweise auf bisher wenig untersuchte Enzyme oder Stoffwechselwege geben.
Vorteile der Shotgun-Metagenomik
- Breite Erfassung der DNA in einer Probe
- Potenzial für eine feinere taxonomische Zuordnung
- Analyse von Genen und möglichen Stoffwechselwegen
- Einbeziehung von Bakterien, Archaeen, Pilzen, Viren und Phagen
- Nachträgliche Neuanalyse vorhandener Sequenzdaten mit aktualisierten Datenbanken
- Möglichkeit, bei ausreichender Datenqualität MAGs zu rekonstruieren
Grenzen und wichtige Fehlerquellen
- Kosten und Aufwand: Sequenzierung, Datenspeicherung und Bioinformatik sind meist aufwendiger als bei Marker-Methoden.
- Probenverzerrung: Entnahme, Lagerung und DNA-Extraktion können bestimmte Organismen begünstigen oder unterrepräsentieren.
- Kontamination: Reagenzien und Umgebung können fremde DNA in eine Probe einbringen.
- Wirts-DNA: In menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Proben kann Wirts-DNA mikrobielle Signale überdecken.
- Referenzdatenbanken: Unbekannte oder schlecht vertretene Organismen lassen sich schwieriger zuordnen.
- Interpretation: Ein nachgewiesenes Gen ist kein Beweis für Aktivität, eine Erkrankung oder eine individuelle Ursache.
- Vergleichbarkeit: Unterschiedliche Protokolle, Sequenzierungstiefen und Auswertungsprogramme können Ergebnisse beeinflussen.
Wie lassen sich verlässliche Ergebnisse fördern?
- Standardisierte Entnahme-, Lagerungs- und Extraktionsprotokolle verwenden
- Negative und positive Kontrollen einplanen
- Technische und biologische Wiederholungen berücksichtigen
- Qualitätsfilter und Kontaminationskontrollen dokumentieren
- Aktuelle, geeignete Referenzdatenbanken nutzen
- Sequenzierungstiefe und statistische Auswertung an die Fragestellung anpassen
- Ergebnisse mit Fachleuten für Mikrobiologie und Bioinformatik interpretieren
Shotgun-Metagenomik beim Darmmikrobiom richtig einordnen
Ein Darmmikrobiom-Test kann eine Momentaufnahme der DNA in einer Stuhlprobe liefern. Die Zusammensetzung variiert jedoch unter anderem mit Ernährung, Medikamenten, Alter, Tageszeit und Probenverarbeitung. Ein einzelnes Ergebnis ist deshalb nur eingeschränkt aussagekräftig und sollte nicht isoliert als Gesundheits- oder Krankheitsbewertung verstanden werden.
Bei anhaltenden, starken oder sich verschlechternden Verdauungsbeschwerden sollten Sie ärztlichen Rat einholen. Ein Mikrobiomtest ersetzt keine Untersuchung, Diagnose oder Behandlung durch qualifiziertes medizinisches Fachpersonal.
Zukünftige Entwicklungen
Längere Reads können die Assemblierung und die Unterscheidung nah verwandter Stämme verbessern. Die Verbindung mit Metatranskriptomik, Metaproteomik und Metabolomik kann zusätzliche Informationen über aktive Prozesse liefern. Fortschritte bei Referenzdatenbanken, Rechenverfahren und maschinellem Lernen könnten die Annotation unbekannter Gene erleichtern. Dennoch müssen solche Vorhersagen weiterhin experimentell und klinisch validiert werden.
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Wie unterscheidet sich Shotgun-Metagenomik von der 16S-rRNA-Sequenzierung?
Shotgun-Metagenomik untersucht viele DNA-Fragmente aus der gesamten Probe. Die 16S-rRNA-Sequenzierung analysiert dagegen einen ausgewählten Markerbereich, der hauptsächlich zur Einordnung von Bakterien und Archaeen dient. Shotgun-Daten können daher zusätzliche Informationen über andere Organismengruppen und potenzielle Gene liefern, sind aber meist aufwendiger.
Welche Sequenzierungstiefe wird benötigt?
Das hängt von Probenart, mikrobieller Vielfalt und Fragestellung ab. Eine komplexe Probe oder die Suche nach seltenen Signalen kann mehr Daten erfordern als eine grobe Übersicht. Eine feste Read-Anzahl ist deshalb nicht für jedes Projekt sinnvoll.
Kann Shotgun-Metagenomik Antibiotikaresistenzgene erkennen?
Sie kann nach bekannten Resistenzgenen oder verwandten Sequenzen suchen, beispielsweise mit spezialisierten Datenbanken. Ein genetischer Hinweis beschreibt jedoch nicht automatisch die tatsächliche Resistenz eines Organismus. Dafür können zusätzliche phänotypische und klinische Untersuchungen erforderlich sein.
Kann die Methode ganze Genome rekonstruieren?
Unter geeigneten Bedingungen können Assemblierungs- und Binning-Verfahren metagenomisch assemblierte Genome, sogenannte MAGs, aus gemischten Proben erzeugen. Die Vollständigkeit und Genauigkeit hängt unter anderem von Sequenzierungstiefe, Genomähnlichkeit und Probenkomplexität ab.