Sequenciação 16S rDNA: como funciona e o que revela
A sequenciação 16S rDNA é uma técnica de análise do microbioma que identifica grupos de bactérias numa amostra, geralmente através de uma região do ADN que codifica o ARN ribossomal 16S. Na prática, permite obter um perfil da composição bacteriana e comparar a abundância relativa dos diferentes grupos. Não é, por si só, um diagnóstico nem mostra tudo o que as bactérias estão a fazer.
O que é a sequenciação 16S rDNA?
O 16S rDNA é o gene bacteriano associado à produção do ARN ribossomal 16S. Este gene contém regiões relativamente conservadas, comuns a muitas bactérias, e regiões variáveis que ajudam a distingui-las. Por funcionar como uma espécie de marcador genético, é frequentemente utilizado para classificar bactérias em estudos e testes do microbioma.
Ao contrário dos métodos baseados apenas em cultura, a sequenciação pode detetar material genético de microrganismos que não crescem facilmente nas condições habituais de laboratório. O resultado é normalmente um perfil taxonómico, com identificação ao nível do filo, género e, em alguns casos, espécie. A precisão depende da região analisada, da qualidade da amostra, do método laboratorial e da base de dados utilizada.
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Qual é a diferença entre 16S rDNA e 16S rRNA?
Os termos estão relacionados, mas referem-se a moléculas diferentes:
- 16S rDNA: é o gene presente no ADN bacteriano, ou seja, a informação genética que serve de modelo.
- 16S rRNA: é a molécula de ARN ribossomal produzida a partir desse gene e integrada nos ribossomas da bactéria.
Na maioria das análises de microbiomas, fala-se em sequenciação 16S, mas o material analisado é o ADN, designado 16S rDNA ou, de forma mais geral, gene 16S. O ADN tende a ser mais estável e simples de preservar do que o ARN. A análise de 16S rRNA exige cuidados adicionais, porque o ARN se degrada mais facilmente. Além disso, a presença de rRNA pode variar com o estado fisiológico da célula, mas não deve ser interpretada isoladamente como uma medição direta da atividade metabólica.
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16S rDNA e 16S rRNA: comparação rápida
| Característica | 16S rDNA | 16S rRNA |
|---|---|---|
| Material analisado | Gene no ADN | Molécula de ARN ribossomal |
| Utilização habitual | Perfil taxonómico de bactérias | Estudos que analisam ARN e expressão relativa |
| Estabilidade | Geralmente mais estável | Mais sensível à degradação |
| Informação principal | Que grupos bacterianos foram detetados | Presença relativa de rRNA na amostra |
Como é feita a sequenciação 16S?
O processo pode variar entre laboratórios, mas costuma incluir estas etapas:
- Recolha da amostra: recolhe-se uma amostra, como fezes, seguindo as instruções do laboratório. Uma amostra de fezes representa sobretudo o material analisado naquele momento e não todas as regiões do intestino.
- Extração do ADN: o laboratório separa o ADN dos microrganismos presentes na amostra. A eficiência da extração pode variar entre tipos de bactérias.
- Amplificação por PCR: são utilizadas pequenas sequências iniciadoras, chamadas primers, para copiar uma região escolhida do gene 16S. Isto produz material suficiente para a leitura.
- Sequenciação: um equipamento lê a ordem dos nucleótidos nas cópias amplificadas.
- Análise bioinformática: as leituras são filtradas, agrupadas e comparadas com bases de dados de referência.
- Relatório: os resultados apresentam geralmente a classificação taxonómica e a abundância relativa dos grupos detetados.
Para que serve o PCR do 16S rDNA?
A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, amplifica uma região específica do ADN. Não identifica sozinha todas as bactérias da amostra: cria cópias da região escolhida para que esta possa ser sequenciada. Os primers, o número de ciclos e as condições do ensaio podem influenciar quais os grupos mais facilmente detetados. Por isso, resultados de laboratórios diferentes nem sempre são diretamente comparáveis.
O que pode mostrar uma análise 16S?
Uma análise baseada no gene 16S pode fornecer várias informações sobre a comunidade bacteriana da amostra:
- Composição taxonómica: indica os grupos de bactérias detetados e o nível de classificação alcançado.
- Abundância relativa: mostra a proporção de cada grupo dentro das sequências analisadas. Não equivale necessariamente ao número absoluto de bactérias.
- Diversidade alfa: descreve a variedade dentro de uma amostra, recorrendo a métricas que podem considerar riqueza e distribuição.
- Diversidade beta: permite comparar a composição de duas ou mais amostras.
- Comparações com referências: alguns relatórios comparam o perfil com grupos de referência, mas essas comparações dependem da população, do método e do contexto.
Uma maior diversidade não deve ser considerada automaticamente sinónimo de melhor saúde, tal como a presença ou ausência de um único microrganismo não permite concluir que existe uma doença. Dieta, medicação, idade, trânsito intestinal, condições de recolha e outros fatores podem influenciar o resultado.
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O 16S é principalmente uma ferramenta para descrever quem foi detetado na amostra. Em geral, não identifica diretamente:
- as funções específicas que cada microrganismo está a desempenhar;
- a quantidade absoluta de cada bactéria, sem métodos adicionais de quantificação;
- vírus, fungos e outros organismos, que exigem abordagens diferentes, como a análise 18S para alguns eucariotas;
- todas as espécies com igual precisão;
- uma causa individual para sintomas digestivos ou um diagnóstico clínico.
A sequenciação metagenómica pode analisar uma gama mais ampla de material genético e oferecer informação funcional potencial, mas também tem limitações, custos e requisitos próprios. A escolha do método deve corresponder à pergunta que se pretende investigar.
Qual é a diferença entre sequenciação 16S e 18S?
A sequenciação 16S é direcionada sobretudo para bactérias e, em alguns contextos, para arqueias. A sequenciação 18S analisa uma região do ARN ribossomal 18S, utilizada para estudar muitos organismos eucariotas, como fungos e parasitas, dependendo do protocolo. Assim, 16S e 18S não são métodos equivalentes nem substitutos universais: o alvo escolhido depende dos microrganismos que se pretende detetar.
Porque é utilizado o 16S na sequenciação?
O gene 16S é utilizado porque está presente em bactérias, tem regiões conservadas que facilitam a amplificação e regiões variáveis que ajudam na classificação. Também existe uma grande quantidade de dados de referência para comparar as sequências. Estas características tornam o método útil para descrever comunidades bacterianas, embora a resolução possa ser insuficiente para distinguir espécies muito próximas.
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Como interpretar um relatório de microbioma?
Leia o relatório como uma descrição da amostra, não como uma avaliação médica isolada. Verifique qual foi o método utilizado, que região do gene foi analisada, o nível de confiança da classificação e se os valores representam abundância relativa ou medidas absolutas. Também é importante saber se foram analisadas bactérias, fungos ou outros grupos.
Não altere medicação, elimine grupos alimentares ou comece suplementos com base apenas num resultado. Se existirem sintomas persistentes, intensos, agravados ou preocupantes, procure um profissional de saúde. O contexto clínico, a história da pessoa e, quando necessário, exames apropriados são essenciais para uma avaliação adequada.
Perguntas frequentes
O que é a sequenciação 16S rDNA?
É uma técnica que lê uma região do gene 16S no ADN bacteriano para classificar os grupos de bactérias presentes numa amostra. É frequentemente usada na análise de comunidades microbianas, incluindo o microbioma intestinal.
Como se faz a sequenciação 16S rRNA?
Quando se diz sequenciação 16S rRNA, muitas vezes está-se a referir à sequenciação do gene 16S no ADN, por uma questão de uso corrente. Nesse caso, o laboratório extrai ADN, amplifica a região 16S por PCR, sequencia as cópias e compara as leituras com bases de dados. Se o objetivo for analisar ARN 16S verdadeiro, é necessário extrair e preservar ARN, convertê-lo habitualmente em ADN complementar e seguir um protocolo específico.
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O 16S é usado principalmente para estudar bactérias e arqueias, enquanto o 18S é usado para analisar muitos organismos eucariotas, como fungos e alguns parasitas. A região escolhida depende do grupo de microrganismos que se pretende investigar.
Porque é utilizado o 16S na sequenciação?
O gene 16S combina regiões conservadas, que permitem a amplificação, com regiões variáveis, que ajudam a distinguir grupos bacterianos. A existência de bases de dados amplas também facilita a comparação e a classificação das sequências.
O que mostra um resultado 16S?
Mostra sobretudo a composição taxonómica e as abundâncias relativas dos grupos bacterianos detetados na amostra. Pode apoiar comparações entre amostras, mas não determina sozinho a saúde intestinal, a causa de sintomas ou a necessidade de um tratamento.
Conclusão
A sequenciação 16S rDNA é uma forma útil de caracterizar bactérias numa amostra e compreender melhor a composição de uma comunidade microbiana. O método envolve extração de ADN, PCR, leitura das sequências e análise bioinformática. Os resultados devem ser interpretados tendo em conta as limitações técnicas e o contexto individual, idealmente com orientação de um profissional de saúde quando existem sintomas ou preocupações clínicas.