Sequenciação 16S: o que é e como funciona
Em resumo: a sequenciação 16S analisa uma região do gene 16S rRNA para identificar os principais grupos de bactérias presentes numa amostra, como uma amostra de fezes. Pode descrever a composição bacteriana, a abundância relativa e algumas métricas de diversidade, mas não diagnostica doenças nem mostra, por si só, todas as funções do microbioma.
É uma abordagem útil para estudar o microbioma intestinal, desde que os resultados sejam interpretados tendo em conta o método utilizado, a qualidade da amostra e as limitações da evidência científica.
O que é a sequenciação 16S de amplicões?
A sequenciação 16S de amplicões é uma técnica de análise de ADN que combina a amplificação e a sequenciação de uma região específica do gene 16S rRNA. Este gene está presente nas bactérias e contém zonas relativamente conservadas e regiões variáveis. A comparação dessas regiões com bases de dados de referência permite atribuir uma classificação taxonómica às sequências encontradas.
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Dependendo da região analisada, da qualidade da sequenciação e da base de dados usada, os resultados podem chegar ao nível do género e, por vezes, da espécie. A identificação ao nível da estirpe é geralmente limitada. Por isso, o resultado deve ser apresentado com o grau de confiança adequado, em vez de sugerir uma precisão superior à que o método permite.
Como funciona a análise 16S?
Embora os procedimentos possam variar entre laboratórios, um fluxo de trabalho típico inclui várias etapas:
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- Recolha da amostra: o material é recolhido de acordo com instruções específicas. O tempo até à preservação e as condições de transporte podem influenciar a qualidade do ADN.
- Extração do ADN: o laboratório separa o ADN microbiano da restante matéria da amostra.
- Amplificação: são copiadas regiões selecionadas do gene 16S com iniciadores, ou primers, específicos.
- Sequenciação: as cópias obtidas são lidas por uma plataforma de sequenciação.
- Controlo de qualidade: são removidas leituras de baixa qualidade, contaminantes, primers residuais e possíveis quimeras, que são sequências artificiais.
- Processamento bioinformático: as leituras podem ser processadas como variantes de sequência de amplicões, conhecidas como ASVs, ou agrupadas em OTUs, dependendo do pipeline utilizado.
- Atribuição taxonómica: as sequências são comparadas com uma base de dados de referência, como a SILVA, para estimar a sua classificação.
- Análise e relatório: os resultados são resumidos através da composição taxonómica, abundâncias relativas e métricas de diversidade.
O que é que a sequenciação 16S nos diz?
A sequenciação 16S responde sobretudo à pergunta: que bactérias foram detetadas e em que proporção relativa? Entre os dados que pode fornecer encontram-se:
- Composição bacteriana: os grupos taxonómicos identificados na amostra.
- Abundância relativa: a proporção de cada grupo em relação ao conjunto de sequências bacterianas analisadas. Não equivale necessariamente ao número absoluto de bactérias.
- Diversidade alfa: descreve a variedade e a distribuição dentro de uma amostra, através de métricas como o índice de Shannon.
- Diversidade beta: compara a composição de duas ou mais amostras, por exemplo, com uma base de referência ou com um grupo de estudo.
Estes dados podem ajudar a caracterizar a estrutura de uma comunidade microbiana. No entanto, a presença de uma bactéria não prova que esteja a causar sintomas, nem permite concluir isoladamente que um microbioma é saudável ou não saudável.
Quais são as limitações da sequenciação 16S?
Conhecer as limitações é essencial para interpretar o relatório de forma responsável:
- Resolução taxonómica variável: algumas sequências não permitem distinguir espécies próximas, e a identificação ao nível da estirpe é habitualmente limitada.
- Abundância relativa, não absoluta: uma percentagem mais elevada de um grupo não significa necessariamente que o seu número absoluto tenha aumentado.
- Dependência dos primers: a escolha dos primers pode favorecer a amplificação de alguns grupos e reduzir a deteção de outros.
- Influência do laboratório: a extração do ADN, a plataforma, o pipeline bioinformático e a base de dados podem afetar os resultados.
- Âmbito limitado: a técnica foi concebida principalmente para bactérias. Não caracteriza fungos, vírus e outros organismos com a mesma abrangência que métodos específicos ou a sequenciação shotgun.
- Relação limitada com a função: a identificação de um grupo bacteriano não demonstra quais os genes ativos, os metabolitos produzidos ou o efeito clínico no indivíduo.
- Variação natural: alimentação, medicação, idade, trânsito intestinal, rotina e momento da recolha podem contribuir para diferenças entre amostras.
16S, amplicões, metabarcoding, shotgun e 18S: qual é a diferença?
Sequenciação de amplicões e 16S
Sequenciação de amplicões é o termo geral para amplificar e sequenciar uma região-alvo de ADN. A sequenciação 16S é um exemplo específico: utiliza uma região do gene 16S para estudar bactérias. Também podem ser escolhidos outros marcadores, dependendo dos organismos que se pretende analisar.
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Metabarcoding descreve a utilização de marcadores genéticos para identificar vários organismos numa amostra complexa. A sequenciação 16S de uma amostra fecal pode ser considerada uma forma de metabarcoding bacteriano, embora os termos não sejam perfeitamente intercambiáveis em todos os contextos.
Qual é a diferença entre 16S e 18S?
O marcador 16S é utilizado principalmente para estudar bactérias e, em alguns contextos, arqueias. O marcador 18S é usado para estudar organismos eucarióticos, como fungos e protistas, dependendo da região escolhida e do desenho do ensaio. Assim, 16S e 18S não são simplesmente versões melhores ou piores da mesma técnica: respondem a perguntas diferentes. Nenhum deles é, por si só, um método completo para caracterizar vírus.
16S e sequenciação shotgun
A sequenciação shotgun lê fragmentos de todo o ADN presente na amostra, em vez de se concentrar num único marcador. Pode oferecer maior resolução e informação sobre genes e potenciais vias funcionais, além de abranger diferentes tipos de microrganismos. Em contrapartida, exige mais recursos e uma interpretação mais complexa. A escolha depende da pergunta científica, do tipo de amostra, do orçamento e do nível de detalhe necessário.
Como interpretar um relatório de microbioma?
Um relatório deve ser lido como uma descrição da amostra no momento da recolha, e não como um diagnóstico médico. Ao analisá-lo, verifique:
- qual o método, a região do 16S e a plataforma utilizados;
- se os resultados são apresentados como abundância relativa;
- qual o nível taxonómico realmente suportado pelos dados;
- que base de dados e critérios de qualidade foram aplicados;
- se existe um grupo de comparação claramente descrito;
- se as conclusões distinguem associação, hipótese e evidência clínica;
- se são evitados índices não validados ou interpretações simplistas, como classificar todo o microbioma com base numa única proporção.
Uma comparação com uma coorte de referência pode ajudar a contextualizar a amostra, mas não substitui a avaliação clínica. Os grupos de referência podem diferir em idade, alimentação, região, medicação e método laboratorial, pelo que não devem ser tratados como um padrão universal.
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Como se relaciona esta abordagem com o consenso científico?
Em dezembro de 2024, um painel internacional publicou no The Lancet uma declaração de consenso sobre a utilização de testes do microbioma na prática clínica. O documento salienta a importância de protocolos transparentes, controlo de qualidade, informação clínica adequada, interpretação multidisciplinar e comunicação clara das limitações.
A InnerBuddies indica que utiliza uma abordagem baseada em sequenciação de amplicões 16S e que considera estas recomendações no desenvolvimento do teste e do relatório. O consenso não significa que um teste de microbioma possa diagnosticar ou orientar sozinho o tratamento de uma doença. A evidência para a utilização clínica de rotina continua a evoluir, e os resultados devem ser entendidos como informação complementar.
Na prática, uma abordagem responsável deve explicar como a amostra foi processada, apresentar os resultados de forma compreensível, evitar conclusões clínicas não demonstradas e incentivar a consulta de um profissional de saúde quando existem sintomas ou preocupações médicas.
Perguntas frequentes sobre sequenciação 16S
Para que é utilizada a sequenciação 16S?
É utilizada sobretudo para identificar e comparar bactérias numa amostra. Em estudos do microbioma intestinal, pode descrever a composição bacteriana, a abundância relativa e a diversidade da comunidade. A sua utilidade depende da qualidade do ensaio e da pergunta colocada; não é, por si só, uma ferramenta de diagnóstico.
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Mostra quais os organismos abrangidos pelo marcador escolhido que foram detetados e qual a sua proporção relativa entre as sequências analisadas. Não mostra necessariamente a quantidade absoluta de cada organismo, a sua atividade biológica ou a causa de um sintoma.
Quais são as limitações da sequenciação de amplicões 16S?
As principais limitações incluem a resolução reduzida para algumas espécies e estirpes, a influência dos primers e do processamento laboratorial, a dependência de abundâncias relativas e a capacidade limitada para avaliar fungos, vírus e funções metabólicas. Os resultados também podem variar com a recolha e o momento da amostra.
Qual é a diferença entre sequenciação 16S e 18S?
A 16S é direcionada principalmente para bactérias e a 18S para organismos eucarióticos, como fungos e protistas, conforme o desenho do teste. São marcadores diferentes, com aplicações e limitações próprias.
Quando deve procurar aconselhamento médico?
Se tiver sintomas digestivos persistentes, intensos, agravados ou acompanhados de sinais preocupantes, procure um profissional de saúde. Um relatório de microbioma não deve ser usado para iniciar, alterar ou suspender medicação, nem para substituir uma avaliação clínica.