Metagenomica shotgun: come si analizza il microbioma
Che cos’è la metagenomica shotgun?
La metagenomica shotgun è un metodo di sequenziamento non mirato che analizza il DNA complessivo presente in un campione. Il DNA viene frammentato casualmente, sequenziato e poi ricostruito e interpretato con strumenti bioinformatici. In questo modo si possono descrivere molti microrganismi contemporaneamente, senza doverli coltivare in laboratorio.
Nel caso di un campione fecale, il metodo può fornire informazioni sulla composizione del microbioma intestinale e sui geni microbici presenti. Può contribuire a identificare batteri, archei, funghi, virus e fagi, oltre a stimare la presenza di geni associati a determinate funzioni. Queste informazioni sono utili soprattutto nella ricerca e nella caratterizzazione del campione; non costituiscono, da sole, una diagnosi o una prescrizione.
Che cosa significa shotgun?
Il termine inglese shotgun, cioè fucile a pallini, descrive il modo in cui il DNA viene trattato: invece di leggere una regione scelta in anticipo, il materiale genetico viene suddiviso casualmente in molti frammenti. Le sequenze ottenute vengono quindi confrontate con banche dati e, quando possibile, assemblate in sequenze più lunghe.
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Il metodo è diverso dal sequenziamento mirato di un singolo gene. Offre una panoramica più ampia, ma richiede più dati, analisi computazionale e controlli di qualità.
Come funziona: il flusso di lavoro
1. Raccolta e conservazione del campione
I campioni possono provenire dall’intestino, dalla bocca, dalla pelle, dal suolo, dall’acqua o da biofilm ambientali. La raccolta deve limitare contaminazioni esterne e degradazione del DNA. Nei test sul microbioma intestinale, è importante seguire con precisione le istruzioni del laboratorio, soprattutto per conservazione, trasporto e registrazione di farmaci o cambiamenti recenti nella dieta.
2. Estrazione del DNA
Il laboratorio estrae il DNA da tutti gli organismi presenti. La procedura deve rompere cellule con pareti diverse, come batteri Gram-positivi e Gram-negativi, riducendo al contempo la presenza di sostanze che possono interferire con il sequenziamento. La qualità e la quantità del DNA influenzano la qualità del risultato.
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3. Preparazione della libreria
Il DNA viene frammentato, preparato alle estremità e collegato ad adattatori. I campioni possono ricevere identificatori molecolari o barcode, così da poterli distinguere durante l’analisi. In questa fase si possono usare protocolli manuali o sistemi automatizzati.
4. Sequenziamento
I frammenti vengono letti da una piattaforma ad alta produttività. La scelta dipende dall’obiettivo, dalla quantità di DNA, dalla complessità del campione e dal budget.
| Piattaforma o approccio | Punto di forza | Considerazione |
|---|---|---|
| Illumina | Letture brevi e generalmente molto accurate | Può essere meno adatta a ricostruire regioni genomiche molto lunghe |
| PacBio HiFi | Letture lunghe con elevata accuratezza di consenso | Può avere costi e requisiti di laboratorio maggiori |
| Oxford Nanopore | Letture lunghe e possibilità di analisi in tempo reale | Le prestazioni dipendono dal protocollo e dalla qualità del campione |
Non esiste una piattaforma migliore in assoluto: la scelta deve essere coerente con la domanda scientifica e con il tipo di campione.
5. Analisi bioinformatica
Le letture vengono controllate, filtrate e interpretate con una pipeline bioinformatica. Le fasi possono includere:
- rimozione di adattatori e letture di bassa qualità;
- riduzione delle sequenze appartenenti all’ospite, quando necessario;
- profilazione tassonomica per stimare quali microrganismi sono presenti;
- annotazione dei geni e delle vie funzionali;
- assemblaggio di sequenze più lunghe e, in alcuni casi, ricostruzione di genomi assemblati dal metagenoma, detti MAG;
- visualizzazione tramite grafici di abbondanza, mappe termiche e analisi di diversità.
Tra gli strumenti comunemente impiegati nella ricerca figurano Kraken2, MetaPhlAn, Bowtie2, MEGAHIT e metaSPAdes. I risultati dipendono anche dalla banca dati utilizzata, dal filtraggio, dalla profondità di sequenziamento e dai criteri adottati dal laboratorio.
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Rispetto a un’analisi basata su un singolo marcatore, la metagenomica shotgun può offrire una descrizione più dettagliata della comunità microbica. Può aiutare a:
- identificare microrganismi a livello di specie e, in alcuni casi, di ceppo;
- rilevare geni microbici associati a vie metaboliche;
- studiare il resistoma, cioè l’insieme dei geni associati alla resistenza agli antimicrobici;
- confrontare campioni raccolti in momenti o condizioni differenti;
- ricostruire, quando i dati lo consentono, parte dei genomi microbici.
La presenza di un gene o di un microrganismo non dimostra automaticamente che una malattia sia presente o che una determinata funzione sia attiva. Per sapere quali geni sono effettivamente espressi servono approcci aggiuntivi, come la metatrascrittomica, e per valutare i prodotti biologici possono essere utili metaproteomica e metabolomica.
Metagenomica shotgun, 16S e Sanger: quali sono le differenze?
| Metodo | Che cosa analizza | Uso tipico |
|---|---|---|
| Metagenomica shotgun | Il DNA complessivo del campione | Profilo tassonomico ampio e analisi potenziale delle funzioni |
| Sequenziamento 16S rRNA | Una regione del gene 16S, soprattutto nei batteri e negli archei | Confronti di composizione microbica con costi e analisi spesso più contenuti |
| Sequenziamento di Sanger | Un frammento di DNA selezionato | Conferma o lettura di una sequenza specifica, non profilazione completa di una comunità |
Il 16S può essere una scelta pratica per confrontare gruppi batterici, ma non fornisce la stessa copertura della metagenomica shotgun e normalmente non descrive virus e funghi con la stessa ampiezza. Sanger è molto accurato per un bersaglio specifico, ma non è progettato per leggere simultaneamente l’intero DNA di una comunità complessa.
Qual è il miglior test per il microbiota?
La risposta dipende dalla domanda. Per una ricerca ampia su specie microbiche e geni funzionali, la metagenomica shotgun può essere appropriata. Per un confronto focalizzato sui batteri, il 16S può essere sufficiente in alcuni progetti. Un test commerciale può differire per tipo di campione, profondità, banca dati, controlli e modo di presentare i risultati.
Prima di scegliere, è utile verificare che il laboratorio spieghi il metodo usato, i limiti di rilevazione, la gestione dei contaminanti, la privacy dei dati genetici e il significato clinico dei risultati. Un referto sul microbiota non dovrebbe sostituire la valutazione di un professionista sanitario, soprattutto in presenza di sintomi persistenti, intensi o in peggioramento.
Quali sono i tipi di sequenziamento del DNA?
I principali approcci includono il sequenziamento mirato, come Sanger e alcuni metodi basati su ampliconi; il sequenziamento massivo parallelo a lettura breve; il sequenziamento a lettura lunga; e la metagenomica shotgun, che applica il sequenziamento massivo a tutto il DNA di una comunità microbica. La scelta dipende da lunghezza delle sequenze, accuratezza richiesta, quantità di campione, costi e obiettivo dell’analisi.
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Possibili applicazioni
Ricerca sul microbioma
La metagenomica shotgun viene usata per confrontare comunità microbiche, studiare la loro diversità e formulare ipotesi sulle funzioni biologiche. Le associazioni osservate tra microbioma e condizioni di salute non dimostrano necessariamente un rapporto di causa ed effetto.
Microbiologia e salute pubblica
In contesti appropriati, il metodo può contribuire alla sorveglianza di microrganismi, alla caratterizzazione di geni di resistenza e allo studio di comunità microbiche complesse. L’uso diagnostico richiede validazione, controlli e interpretazione da parte di laboratori qualificati.
Agricoltura e ambiente
Può essere applicato allo studio del microbioma del suolo e delle piante, al monitoraggio di acqua e biofilm e alla ricerca su processi come il ciclo del carbonio o il biorisanamento. Queste applicazioni sono spesso integrate con dati ecologici e chimici.
Biotecnologia
L’analisi di comunità microbiche può aiutare a individuare enzimi, vie metaboliche o composti di interesse per la ricerca. Ogni candidato richiede ulteriori verifiche sperimentali prima di qualsiasi applicazione.
Vantaggi e limiti
Vantaggi
- copertura più ampia rispetto a un singolo gene bersaglio;
- possibile risoluzione a livello di specie o ceppo, quando i dati sono sufficienti;
- informazioni sui geni e sulle funzioni potenziali;
- possibilità di rianalizzare i dati con banche dati aggiornate;
- rilevazione di gruppi diversi, inclusi batteri, archei, funghi e virus.
Limiti
- costi di sequenziamento, archiviazione e analisi spesso superiori a quelli dei metodi mirati;
- necessità di competenze bioinformatiche e di pipeline ben documentate;
- risultati influenzati da qualità del campione, contaminazione, profondità e banca dati;
- DNA dell’ospite potenzialmente abbondante nei campioni umani;
- funzioni dedotte dai geni presenti, non necessariamente misurate direttamente;
- possibile difficoltà nel distinguere materiale genetico residuo da microrganismi vivi.
Come ottenere risultati più affidabili
- Usare materiali sterili e controlli negativi per individuare contaminazioni.
- Documentare raccolta, conservazione, farmaci e condizioni di trasporto.
- Applicare controlli di qualità alle letture e descrivere i criteri di filtraggio.
- Considerare repliche tecniche o biologiche quando il progetto lo richiede.
- Usare banche dati aggiornate e riportare la versione impiegata.
- Interpretare le differenze tra campioni insieme al contesto biologico e clinico.
Direzioni future
L’integrazione tra letture lunghe e brevi può migliorare l’assemblaggio di genomi complessi. La metatrascrittomica può aggiungere informazioni sull’attività dei geni, mentre metaproteomica e metabolomica aiutano a studiare proteine e metaboliti. Anche gli strumenti di apprendimento automatico possono facilitare l’annotazione, ma le loro previsioni devono essere validate e non sostituiscono la verifica sperimentale.
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Che cos’è lo shotgun?
È un approccio che frammenta casualmente il DNA di un campione e sequenzia molti frammenti in parallelo. Nel microbioma, permette di analizzare il DNA complessivo della comunità invece di concentrarsi su un solo gene.
Qual è il miglior test per il microbiota?
Non esiste un test migliore per ogni obiettivo. La metagenomica shotgun è più ampia, mentre il 16S può essere adeguato per una caratterizzazione batterica mirata. Il metodo, il laboratorio e l’interpretazione del referto sono importanti quanto la tecnologia scelta.
Quali sono i tipi di sequenziamento del DNA?
Tra i principali vi sono il sequenziamento mirato di Sanger, il sequenziamento massivo a lettura breve, il sequenziamento a lettura lunga e la metagenomica shotgun, che analizza il DNA complessivo di una comunità.
Come funziona il metodo di Sanger?
Il metodo di Sanger copia un frammento di DNA usando terminatori che interrompono la sintesi in punti diversi. La lunghezza dei frammenti consente di ricostruire la sequenza del bersaglio. È utile per sequenze specifiche, ma non è pensato per profilare da solo un intero microbioma.
La metagenomica shotgun fornisce una diagnosi?
Non automaticamente. Un risultato metagenomico descrive materiale genetico e possibili funzioni secondo il metodo usato. Il significato clinico deve essere valutato da un professionista qualificato nel contesto dei sintomi, della storia della persona e di altri esami.