16S-sequencing: zo analyseer je het darmmicrobioom
16S-sequencing is een moleculaire analysemethode waarmee onderzoekers bacteriën en archaea in een complexe microbiële gemeenschap, zoals het darmmicrobioom, kunnen herkennen en vergelijken. De methode richt zich op het 16S rRNA-gen. Je leert hieronder waarvoor 16S-sequencing wordt gebruikt, hoe de workflow verloopt en wanneer full-length sequencing nuttig kan zijn. De uitkomst is een onderzoeksprofiel van aanwezige micro-organismen, geen medische diagnose.
Waarvoor wordt 16S-sequencing gebruikt?
Het 16S rRNA-gen komt voor in bacteriën en archaea en bevat zowel relatief stabiele als variabele delen. Door deze sequenties te vergelijken met referentiedatabases kunnen onderzoekers de samenstelling van een microbiële gemeenschap in kaart brengen.
- Microbioomprofilering: onderzoeken welke bacteriële groepen in een monster aanwezig zijn.
- Diversiteitsanalyse: de rijkdom en onderlinge variatie van microbiële gemeenschappen vergelijken.
- Taxonomische classificatie: micro-organismen indelen, vaak op geslachtsniveau en soms met verdere resolutie.
- Vergelijkende studies: verschillen tussen monsters, populaties of tijdstippen onderzoeken.
- Interventieonderzoek: veranderingen in een microbiële gemeenschap volgen na bijvoorbeeld een dieetinterventie of andere onderzoeksinterventie.
16S-sequencing laat zien welke bacteriële DNA-sequenties in een monster worden gevonden. Het meet niet rechtstreeks alle functies van die bacteriën en bewijst op zichzelf niet dat een micro-organisme een klacht of aandoening veroorzaakt.
Ontdek de microbioom test
ISO-gecertificeerd EU-laboratorium • Monster blijft stabiel tijdens verzending • GDPR-veilige gegevens
Hoe werkt 16S-sequencing?
1. Monster verzamelen
Bij onderzoek naar het darmmicrobioom wordt meestal een ontlastingsmonster gebruikt. De manier van verzamelen, bewaren en transporteren kan de kwaliteit van het DNA en daarmee de analyse beïnvloeden. Volg daarom altijd het protocol van het laboratorium of de onderzoeksinstelling.
2. DNA isoleren
In het laboratorium wordt DNA uit het monster gehaald. Omdat bacteriën verschillende celwanden hebben, is een extractiemethode nodig die zo veel mogelijk relevante bacteriële DNA-fragmenten vrijmaakt. Kwaliteitscontroles helpen om de hoeveelheid en zuiverheid van het DNA te beoordelen.
Bekijk voorbeeldaanbevelingen van het InnerBuddies-platform
Bekijk alvast de aanbevelingen voor voeding, supplementen, het voedingsdagboek en recepten die InnerBuddies kan genereren op basis van je darmmicrobioomtest
3. Het 16S rRNA-gen vermenigvuldigen
Met PCR en gerichte primers wordt een deel van of het volledige 16S rRNA-gen vermenigvuldigd. Bij partiële sequencing worden meestal één of meerdere variabele regio’s onderzocht. Bij full-length 16S-sequencing wordt het gen van ongeveer 1.500 basenparen als geheel gelezen, voor zover de gebruikte techniek en de kwaliteit van het materiaal dat toelaten.
4. Een sequencingbibliotheek voorbereiden
De DNA-fragmenten krijgen doorgaans adapters en een barcode. Daardoor kunnen meerdere monsters in één sequencingrun worden gecombineerd en later opnieuw aan het juiste monster worden gekoppeld.
5. De sequenties uitlezen
Het uitlezen gebeurt met een platform dat geschikt is voor de gekozen toepassing. Voorbeelden zijn Illumina, PacBio en Oxford Nanopore. Elk platform heeft eigen eigenschappen op het gebied van leeslengte, nauwkeurigheid, snelheid en kosten.
6. Bio-informatica en interpretatie
Na het uitlezen worden de gegevens gecontroleerd en verwerkt. Veelgebruikte stappen zijn het verwijderen van lage-kwaliteitreads en mogelijke chimere sequenties, het samenvoegen of corrigeren van reads en het vergelijken met een taxonomische referentiedatabase. De gekozen database, primers, kwaliteitsdrempels en analysemethode kunnen de uitkomst beïnvloeden.
Wat bevat een 16S-sequenceringskit?
De inhoud verschilt per leverancier en per onderzoeksworkflow. Een kit of laboratoriumpakket kan onder meer bestaan uit:
2-minuten zelfcheck Is een darmmicrobioomtest nuttig voor jou? Beantwoord een paar korte vragen en ontdek of een microbioomtest echt nuttig is voor jou. ✔ Duurt slechts 2 minuten ✔ Gebaseerd op je klachten & leefstijl ✔ Duidelijke ja/nee aanbeveling Check of een test bij mij past →- materialen voor monsterverzameling en eventuele stabilisatie;
- reagentia voor DNA-extractie;
- PCR-primers voor specifieke 16S-regio’s of het volledige gen;
- reagentia voor bibliotheekvoorbereiding, adapters en barcodes;
- controles voor kwaliteitsbewaking;
- protocollen en soms software of ondersteuning voor data-analyse.
Een sequenceringskit is niet hetzelfde als een volledige analyse. Voor de sequencing zelf, kwaliteitscontrole en bio-informatica zijn vaak gespecialiseerde apparatuur, laboratoriumkennis en passende software nodig.
Full-length versus partiële 16S-sequencing
Bij partiële sequencing worden geselecteerde variabele regio’s van het 16S rRNA-gen gelezen. Full-length sequencing probeert het volledige gen te analyseren. De keuze hangt af van de onderzoeksvraag, het platform, het beschikbare budget en de gewenste taxonomische resolutie.
Mogelijke voordelen van full-length 16S-sequencing
- Meer sequentie-informatie kan helpen om nauw verwante bacteriën beter van elkaar te onderscheiden.
- De combinatie van meerdere variabele regio’s kan de taxonomische classificatie verbeteren.
- De methode kan geschikt zijn wanneer identificatie met hogere resolutie belangrijk is.
- Volledige sequenties kunnen aanvullende informatie bieden voor fylogenetische vergelijkingen.
Full-length betekent niet automatisch dat iedere bacterie betrouwbaar tot op soort- of stamniveau kan worden geïdentificeerd. De uitkomst hangt ook af van de kwaliteit van het monster, de gebruikte primers, het sequencingplatform en de referentiedatabase. Partiële sequencing kan juist efficiënt en geschikt zijn voor grotere vergelijkende studies.
Wat is het verschil tussen 16S- en 18S-sequencing?
16S-sequencing richt zich voornamelijk op bacteriën en archaea. 18S-sequencing wordt gebruikt voor eukaryote organismen, zoals bepaalde schimmels, protisten en andere eukaryote micro-organismen. Voor schimmels wordt in microbioomonderzoek ook vaak het ITS-gebied onderzocht. De keuze voor 16S, 18S of ITS hangt af van de groep organismen die je wilt bestuderen.
Hoe kies je een 16S-sequenceringsworkflow?
Begin met de biologische vraag in plaats van met het sequencingplatform. Bespreek vooraf:
Word lid van de InnerBuddies-community
Voer elke paar maanden een darmmicrobioomtest uit en volg je vooruitgang terwijl je onze aanbevelingen opvolgt
- Welke organismen moeten worden gedetecteerd?
- Is een globale vergelijking voldoende, of is een hogere taxonomische resolutie gewenst?
- Hoeveel monsters worden geanalyseerd en zijn er technische of negatieve controles?
- Welke variabele regio’s, primers en referentiedatabase worden gebruikt?
- Welke kwaliteitscontroles, rapportage en bio-informatica zijn inbegrepen?
- Wordt het monster door een laboratorium verwerkt of is een deel van de workflow intern beschikbaar?
Een laboratorium of onderzoeksdienst kan helpen om deze keuzes af te stemmen op het type monster en de onderzoeksvraag.
Wat kost 16S-sequencing?
Er is geen universele prijs. De totale kosten worden onder meer bepaald door het aantal monsters, het type sequencing, de gewenste leesdiepte, DNA-extractie, bibliotheekvoorbereiding, kwaliteitscontrole, data-analyse en rapportage. Full-length sequencing kan door de langere reads en de gekozen technologie anders geprijsd zijn dan partiële sequencing. Vraag bij een aanbieder na welke stappen en analyses in de prijs zijn inbegrepen.
Toepassingen in onderzoek naar het darmmicrobioom
Onderzoekers gebruiken 16S-sequencing onder meer om:
- microbiële gemeenschappen in verschillende monsters te vergelijken;
- veranderingen over meerdere meetmomenten te volgen;
- de samenstelling van het microbioom in relatie tot voeding of leefstijl te bestuderen;
- de uitkomst van preklinische of voedingsinterventies te onderzoeken;
- methoden voor monsterverwerking en bio-informatica te vergelijken.
Een microbiomeresultaat beschrijft een momentopname of een patroon binnen de gebruikte onderzoeksmethode. Het is geen op zichzelf staande medische test en moet niet worden gebruikt om zelf een aandoening vast te stellen of een behandeling aan te passen.
Veelgestelde vragen over 16S-sequencing
Waarvoor wordt 16S-sequencing gebruikt?
De techniek wordt gebruikt om bacteriën en archaea in een monster te identificeren en microbiële gemeenschappen te vergelijken. In onderzoek naar het darmmicrobioom kan dit bijvoorbeeld inzicht geven in relatieve samenstelling en diversiteit.
2-minuten zelfcheck Is een darmmicrobioomtest nuttig voor jou? Beantwoord een paar korte vragen en ontdek of een microbioomtest echt nuttig is voor jou. ✔ Duurt slechts 2 minuten ✔ Gebaseerd op je klachten & leefstijl ✔ Duidelijke ja/nee aanbeveling Check of een test bij mij past →Hoe wordt 16S rRNA gesequenced?
De algemene workflow bestaat uit monsterverzameling, DNA-extractie, PCR-amplificatie van een deel van of het volledige 16S rRNA-gen, bibliotheekvoorbereiding, sequencing en bio-informatica. De precieze stappen verschillen per protocol en platform.
Waarom wordt het 16S rRNA-gen gebruikt voor sequencing?
Het gen is aanwezig in bacteriën en archaea en bevat delen die tussen soorten verschillen. Daardoor kan het worden gebruikt als een soort moleculaire marker voor taxonomische classificatie, terwijl geconserveerde delen helpen bij het ontwerpen van primers.
Wat is het verschil tussen 16S- en 18S-sequencing?
16S-sequencing is vooral gericht op bacteriën en archaea. 18S-sequencing richt zich op eukaryote micro-organismen. Voor schimmels wordt vaak ITS-sequencing gebruikt. Geen van deze methoden beschrijft automatisch de volledige microbiële gemeenschap.
Kan 16S-sequencing alle micro-organismen aantonen?
Nee. De methode is niet bedoeld om alle micro-organismen te detecteren. Virussen, schimmels en andere eukaryoten vragen doorgaans om andere analysetargets. Ook kunnen technische keuzes en de detectielimiet ervoor zorgen dat bepaalde organismen niet worden waargenomen.
Conclusie
16S-sequencing is een praktische onderzoeksmethode om bacteriën en archaea in een microbiële gemeenschap te profileren. Full-length sequencing kan extra sequentie-informatie bieden, maar de kwaliteit en interpretatie hangen af van de volledige workflow. Kies de methode op basis van je onderzoeksvraag en bespreek medische of aanhoudende klachten met een gekwalificeerde zorgprofessional; een microbiomeprofiel vervangt geen medische beoordeling.