Sequenziamento 16S rDNA: come si analizza il microbioma
In breve: il sequenziamento 16S rDNA analizza una regione del DNA presente nei batteri e in altri procarioti per stimare quali microrganismi sono presenti in un campione e in quale abbondanza relativa. Nel microbioma intestinale è una tecnica di profilazione, non un test diagnostico: aiuta a descrivere la comunità microbica, ma non stabilisce da sola se una persona sia malata o in buona salute.
Che cos’è il sequenziamento 16S rDNA?
Il 16S rDNA è il gene che contiene le istruzioni per produrre l’RNA ribosomiale 16S, una componente del ribosoma dei batteri e degli Archaea. Il gene comprende regioni relativamente conservate, utili per riconoscere il bersaglio, e regioni variabili, che permettono di confrontare le sequenze e assegnarle a gruppi tassonomici.
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Nel caso di un campione fecale, il metodo viene usato per descrivere la composizione batterica del microbioma. In genere il risultato è più affidabile a livello di famiglia o genere; l’identificazione precisa della specie non è sempre possibile, perché specie diverse possono avere sequenze 16S molto simili.
16S rDNA e 16S rRNA: qual è la differenza?
I due termini sono collegati, ma non indicano la stessa molecola:
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| Caratteristica | 16S rDNA | 16S rRNA |
|---|---|---|
| Che cos’è | Il gene presente nel DNA del microrganismo | La molecola di RNA prodotta a partire da quel gene |
| Ruolo | Contiene le informazioni per una componente del ribosoma | Fa parte del ribosoma e contribuisce alla sintesi delle proteine |
| Stabilità | Generalmente più stabile e più semplice da conservare | Più soggetto a degradazione e dipendente dalle condizioni del campione |
| Uso più comune | Profilazione tassonomica della comunità microbica | Studi di ricerca sull’RNA e sull’attività cellulare |
Quando si parla di sequenziamento 16S rRNA in articoli divulgativi o nei servizi di profilazione, spesso si intende in realtà il sequenziamento del gene 16S rDNA. L’analisi diretta dell’RNA richiede procedure aggiuntive, come la conversione in cDNA, e non è il metodo standard per la maggior parte dei test di profilazione del microbioma.
A cosa serve la PCR 16S rDNA?
La PCR, o reazione a catena della polimerasi, amplifica una regione selezionata del gene 16S rDNA. In questo modo il laboratorio può ottenere abbastanza copie del bersaglio per procedere al sequenziamento e all’analisi bioinformatica.
Che cosa accade durante la PCR?
- Selezione del bersaglio: brevi sequenze chiamate primer si legano a regioni del gene 16S.
- Amplificazione: cicli ripetuti copiano la regione compresa tra i primer.
- Preparazione del campione: il prodotto amplificato viene controllato e preparato per il sequenziamento.
I primer e le condizioni di laboratorio possono favorire alcuni gruppi microbici più di altri. Per questo la PCR può introdurre un bias e le percentuali del report devono essere interpretate come abbondanze relative stimate, non come conteggi assoluti perfetti.
Come si svolge un’analisi 16S del microbioma?
- Raccolta del campione: il campione fecale viene raccolto seguendo le istruzioni del laboratorio.
- Estrazione del DNA: si estrae il DNA totale, che comprende il materiale genetico dei microrganismi presenti.
- PCR 16S: viene amplificata la regione scelta del gene 16S.
- Sequenziamento: le copie amplificate vengono lette con una tecnologia di sequenziamento.
- Controllo bioinformatico: le sequenze di bassa qualità o potenzialmente errate vengono filtrate.
- Classificazione: le sequenze vengono confrontate con database di riferimento e assegnate a gruppi tassonomici.
I dati possono essere organizzati come OTU, cioè unità tassonomiche operative, oppure ASV, varianti di sequenza di amplicone. Il report può mostrare la diversità, la presenza relativa di determinati gruppi e confronti con database o popolazioni di riferimento. Queste informazioni sono descrittive e dipendono dal campione, dal metodo, dal database e dai criteri di analisi utilizzati.
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Il bersaglio 16S e il bersaglio 18S vengono scelti per studiare gruppi diversi di organismi:
| Caratteristica | 16S rDNA | 18S rDNA |
|---|---|---|
| Organismi principali | Batteri e Archaea | Organismi eucarioti, inclusi funghi e protozoi |
| Applicazione | Profilazione della componente batterica | Studio della componente eucariotica, come il micobioma |
| Informazione ottenuta | Composizione tassonomica dei microrganismi bersaglio | Composizione degli eucarioti bersaglio |
Un’analisi 16S non descrive automaticamente funghi, protozoi o virus. Per studiare questi gruppi sono necessari marcatori, metodi e controlli specifici.
Che cosa può e non può dirti il sequenziamento 16S?
Che cosa può indicare
- Quali gruppi batterici sono stati rilevati nel campione.
- Come è distribuita, in termini relativi, la comunità analizzata.
- Alcuni indicatori descrittivi di diversità, se previsti dal metodo.
- Possibili aree di interesse da discutere in un percorso di educazione alimentare e di benessere.
Quali sono i limiti
- Risoluzione tassonomica: il metodo non distingue sempre specie o ceppi molto simili.
- Abbondanza relativa: un aumento percentuale di un gruppo non significa necessariamente che il suo numero assoluto sia aumentato.
- Bias tecnici: raccolta, estrazione, primer, sequenziamento e database possono influenzare il risultato.
- Funzione non misurata direttamente: sapere quali microrganismi sono presenti non equivale a sapere che cosa stanno facendo.
- Variabilità nel tempo: alimentazione, farmaci, viaggi, stress e altre condizioni possono influire sul microbioma e sul campione.
Per una valutazione più approfondita delle funzioni microbiche possono essere impiegati altri approcci, come la metagenomica shotgun o l’analisi dell’RNA, ma la scelta dipende dall’obiettivo e dal contesto di ricerca.
Come leggere un report del microbioma in modo prudente
Un report 16S può essere uno strumento informativo per conoscere meglio la composizione del proprio campione, ma non dovrebbe essere interpretato in modo isolato. È utile verificare:
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- il tipo di campione e le modalità di raccolta;
- il bersaglio analizzato e le regioni 16S utilizzate;
- il database di riferimento e il livello di classificazione raggiunto;
- se i risultati sono relativi o assoluti;
- quali raccomandazioni sono basate su dati generali e quali su evidenze più solide.
Le indicazioni alimentari generali, come aumentare gradualmente la varietà di alimenti vegetali se compatibile con le proprie esigenze, devono essere adattate alla persona e non sostituiscono il parere di un professionista sanitario. Un test del microbioma non diagnostica disturbi intestinali, allergie, intolleranze o altre malattie.
Il cromosoma 16 è collegato al 16S?
No. Il termine 16S non indica il cromosoma 16 umano. La lettera S si riferisce all’unità di sedimentazione Svedberg e identifica una componente ribosomiale. Il 16S rDNA è un marcatore genetico usato soprattutto per studiare batteri e Archaea; il cromosoma 16 è invece uno dei cromosomi del genoma umano. Sono concetti distinti, anche se il numero può creare confusione.
Domande frequenti
Che cos’è l’RNA ribosomiale?
L’RNA ribosomiale, o rRNA, è una molecola di RNA che insieme alle proteine forma i ribosomi, le strutture cellulari coinvolte nella produzione delle proteine. Il 16S rRNA è la componente ribosomiale tipica dei batteri e degli Archaea; il gene che la codifica è chiamato 16S rDNA.
Il sequenziamento 16S rDNA è un test diagnostico?
No. In un contesto di benessere, il test descrive la composizione microbica del campione e non può confermare o escludere una malattia. In presenza di sintomi persistenti, intensi o preoccupanti è opportuno rivolgersi a un medico.
Controllo rapido in 2 minuti Un test del microbioma intestinale è utile per te? Rispondi a poche domande veloci e scopri se un test del microbioma è davvero utile per te. ✔ Richiede solo 2 minuti ✔ Basato sui tuoi sintomi e stile di vita ✔ Raccomandazione chiara sì/no Scopri se il test è adatto a me →Il test mostra tutti i microrganismi presenti nell’intestino?
No. Il risultato dipende dal campione, dal marcatore analizzato, dai primer, dalla qualità del DNA e dal database utilizzato. Il 16S riguarda soprattutto batteri e Archaea e non è progettato per descrivere automaticamente virus o funghi.
Che cosa si può fare dopo aver ricevuto il report?
Il report può aiutare a formulare domande e a riflettere sulle abitudini quotidiane, ma non dovrebbe portare a eliminare alimenti, iniziare integratori o modificare terapie senza un confronto con un professionista qualificato. Eventuali cambiamenti alimentari vanno introdotti gradualmente e tenendo conto delle esigenze individuali.
Conclusione
Il sequenziamento 16S rDNA è un metodo consolidato per descrivere la componente batterica di un microbioma. La PCR amplifica il bersaglio, il sequenziamento legge le sequenze e l’analisi bioinformatica le collega a gruppi tassonomici. Comprendere la differenza tra 16S rDNA, 16S rRNA e 18S rDNA aiuta a leggere i risultati con maggiore consapevolezza, ricordando che un profilo microbico è una fotografia parziale e non una diagnosi clinica.